食用菌精准育种实验室
Laboratory of Mushroom Precision Breeding
什么是LAMP？
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人于2000年提出来的一种新的核酸扩增技术。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，可以在60-65℃温度范围内进行恒温扩增。在扩增的初始阶段，由于引物的延伸和初级扩增子的连续链置换，形成了哑铃状反应中间体，相较于PCR反应扩增机制更为复杂，但是却大大缩短了扩增时间，15-60分钟内即可实现109-1010核酸扩增，可以一步完成基因的扩增和检测，已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。
LAMP的作用机制
LAMP 反应可分为复制起始、循环扩增，延伸三个阶段（如下图所示）。LAMP不同于PCR，它不需要通过热变性来促进双链DNA转化为单链。在复制起始阶段，由于双链DNA在65°C条件下处于动态平衡稳定状态，一条LAMP引物可以与双链靶基因的互补序列结合，在链置换DNA聚合酶作用下，启动DNA的合成，最终形成哑铃状互补链，即为进入循环扩增的起始原料。继而通过连续链置换进入循环扩增阶段，最后延伸阶段，扩增的最后产物是具有不同个茎环结构、多环花椰菜样结构的DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
图1. LAMP 反应过程图。F1、F2、F3是靶基因上约20 bp长的序列片段，B1、B2、B3则是位于互补链上长度约20 bp的序列，F1c和B1c分别是F1和B1的互补区。
LAMP与PCR扩增区别
什么是RT-LAMP？
逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP) 将环介导等温扩增(LAMP)与逆转录反应相结合，直接检测出RNA的方法，当它与反应混合物中的pH指示剂耦合时，可以通过颜色变化获得检测结果。在新冠检测应用上，可以在60-65°C等温条件下，一步进行RNA逆转录和核酸扩增过程，30 min即可得到结果，同时检测ORF1ab基因、E基因和N基因。由于ORF1ab基因具有很强的特异性，N基因具有很强的敏感性，这种方法可以保证病毒检测的灵敏性和特异性。
RT-LAMP与RT-qPCR的区别？
★LAMP引物设计
LAMP的特点是使用4或6种不同的引物，专门设计用于识别目标基因的6个不同区域，包括3'端的F3c、F2c和F1c区域和5'端的B1、B2和B3区域，如图1所示。引物设计包括：
正向内引物（Forward Inner Primer, FIP）：由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5’端的F1c区域序列相同；
正向外引物（Forward Outer Primer , FOP/ F3 ）：由F3区组成，与靶基因的F3c区域互补；
反向内引物（ Backward Inner Primer , BIP ）：由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1c区域与靶基因5’端的B1c区域序列相同；
反向外引物（Backward Outer Primer, BOP/B3）：由B3区域组成，与靶基因的B3c区域互补。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 Notomi 等人于 2000 年提出来的一种新的核酸扩增技术，已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等 领域，显示出了令人鼓舞的应用前景。
LAMP 技术利用一种具有高度链置换活性的 Bst DNA 聚合酶，较传统核酸扩增技术具 有以下优势:
(1)等温条件下扩增，合理避免了常规 PCR 对温度循环的特殊要求所带来的 种种不便。
(2)高效灵敏，在 45~60 min 的时间内，扩增效率可达到 109~1010 个数量级， 扩增模板极限仅为几个拷贝。
(3)特异性强，采用 4 条引物，识别靶基因的 6 个位点，保证 扩增的特异性。
(4)费用低，不需要昂贵的精密仪器和特殊试剂。
(5)操作简便，不需要进 行双链 DNA 的预变性，在一管内即可以完成全部检测。
(6)检测简单，在核酸大量合成时， 产生副产物—焦磷酸镁沉淀，有极高的特异性。只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能 够判断扩增与否。
(7)扩增 RNA 模板，反应体系中加入逆转录酶，即可一步实现 RNA 的 高效扩增。LAMP 反应可分为复制起始、循环扩增，延伸三个阶段，具体过程如下:
首先，是复制起始阶段。由于双链 DNA 在 65°C条件下处于动态平衡稳定状态，一条 LAMP 引物可以跟双链靶基因中的互补序列结合，继而利用 DNA 聚合酶的链置换活性启动 DNA 合成，从而取代并释放另一条单链 DNA。因此，LAMP 不同于 PCR，它不需要通过热 变性来促进双链 DNA 转化为单链。如图 6.1 中所示，上游内部引物 FIP(Forward Inner Primer) 与释放的单链 DNA 模板(1)结合，启动 DNA 的合成。在 DNA 聚合酶链置换活性作用下， 自 FIP 的 3’端 F2 处开始，合成了一条与模板 DNA 序列互补的 DNA 链(2)。
上游外部引物 F3(Forward Outer Primer)比 FIP 短几个碱基，且浓度比 FIP 低，它缓 慢地与目标 DNA 中的 F3c 互补配对(3)，启动链置换 DNA 合成，最终再次形成双链模板 DNA(4)。释放 FIP 连接的互补链(5)，其 5’端 F1c 与 F1 区域互补，形成颈环结构。
FIP 连接的互补链(5)作为模板供下游内部引物 BIP(Backward Inner Primer)结合并 启动 DNA 合成。继而下游外部引物 B3(Backward Outer Primer)与 B3c 区互补结合，在链 置换 DNA 聚合酶的作用下引导双链 DNA 的合成(7)，并释放 BIP 引导合成的哑铃状互补 链(8)，该链即为 LAMP 反应进入循环扩增阶段的起始材料。
图 6.1 LAMP 复制起始阶段示意图
其次，是循环扩增阶段。如图 6.2 中所示，哑铃状 DNA 链(8)通过 F1 区 3’端自身 引导的 DNA 合成迅速转化为颈环结构。FIP 与茎环状 DNA 的单链区 F2c 结合，开始链置换 合成，解离出之前的合成链，这条释放的单链 DNA 由于 3’端存在 B1c 和 B1 互补区，从 而也会形成颈环状结构(9)，继而以该链 3’端 B1 区作为起始位点，继续引导以自身为模 板的 DNA 合成(9)，并释放之前 FIP 引导合成的互补链。此次释放的单链 DNA 由于两端 分别存在 F1-F1c 和 B1-B1c 两个互补区，因此形成哑铃状结构(11)，恰好是(8)的翻转结 构。类似于从(8)到(11)的过程，哑铃状结构(11)迅速以 3’末端的 B1 区段为起点， 以自身为模板合成 DNA。进而 BIP 与 B2c 区结合，引导链置换 DNA 合成，释放之前由 B1 引导合成的 DNA 链。随后产生与(9)和(10)相似的结构，以及哑铃状 DNA(8)。由此 形成循环扩增。
图 6.2 LAMP 循环扩增阶段示意图
最后，延伸阶段。如图 6.3 所示，由颈环状 DNA(10)为模板，BIP 与单链 B2c 区结 合，启动链置换 DNA 合成，形成颈环 DNA(12)，继而以其 3’端 B1 区为起始位点，引导 以自身为模板的链置换 DNA 合成，产生长短不一的 2 条新茎环状结构的 DNA(13)和(16)。 BIP 引物上的 B2 与颈环 DNA(13)杂交，启动新一轮扩增，且产物 DNA 长度增加一倍。 因此，扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、多环花椰菜样结构的 DNA 的混合物。且 产物 DNA 为扩增靶序列的交替反向重复序列。
在反应体系中还可以添加环状引物 LF(Loop Primer Forward)和 LB(Loop Primer Backward)，它们可以跟哑铃状结构 5’端的环状区(位于 B1 和 B2 之间，或者 F1 和 F2 之 间)进行结合，从而增加 DNA 合成的起始位点。如图 6.4 所示，其中含有 6 个环状结构的 扩增产物，在基本的 LAMP 方法中，有 4 个环是无法利用的，但加入环引物后，所有的单 链环都可以作为 DNA 合成的起始位点。因此，环引物可明显增加 LAMP 扩增的效率，缩短 反应时间。大量研究结果显示环引物可将扩增时间缩短 1/3 至 1/2，30min 内即可出现阳性 扩增(图 6.5)。
图 6.3 LAMP 延伸阶段示意图
图 6.4 环引物在 LAMP 扩增中的作用示意图
图 6.5 星状病毒环引物对 RT-LAMP 扩增的影响
LAMP 引物设计基于靶序列上自 5’端开始依次标识为 F3、F2、F1、B1、B2、B3 的 6 个不同的区域(图 6.6)，其中 F1、F2、F3 是靶基因上约 20bp 长的序列片段，B1、B2、B3 则是位于互补链上长度约 20bp 的序列，F1c 和 B1c 分别是 F1 和 B1 的互补区。4 条引物包 括上游外部引物 F3(Forward Outer Primer)、下游外部引物 B3(Backward Outer Primer)、 上游内部引物 FIP(Forward Inner Primer)和下游内部引物 BIP(Backward Inner Primer)。 各引物序列片段构成见图 6.6。此外，还可在 F1c 和 F2c 之间，或者 B1c 和 B2c 之间设计一 条或两条环引物 LF(Loop Primer Forward)、LB(Loop Primer Backward)，促进 LAMP 扩 增效率。
图 6.6 LAMP 引物示意图
LAMP 引物设计有 4 个关键影响因素:Tm 值、引物末端稳定性、GC 含量~和二级结构。 首先，Tm 值即 DNA 熔解温度。GC 含量占优势的序列 Tm 值在 60°C~65°C范围内，其中 F1c 和 B1c 要求 Tm 值 65°C(64°C~66°C)，F2、F3、B2、B3 要求 Tm 值 60°C(59°C~61°C)， 环引物 Tm 值 65°C(64°C~66°C)。反之，AT 含量占优势的序列 Tm 值则在 55°C~60°C范围 内。其次，引物的末端作为 DNA 合成的起始位点必须有一定程度的稳定性。F2/B2、F3/B3 和 LF/LB 的 3’端以及 F1c 和 B1c 的 5’端自由能应不大于-4kcal/mol。自由能变化(∆G)等 于引物与模板结合后产物自由能减去初始反应物自由能。引物与模板的结合是一个平衡反应， 只有当∆G 小于零时结合反应才会发生，且∆G 越小(负数的绝对值越大)，引物越容易同模 板结合。此外，引物 GC 含量应在 40%至 65%之间，在 50%~60%范围内时为最佳。同时， 所设计的引物尤其是内引物不易形成二级结构也同样非常重要，为防止引物二聚体的形成， 需要确保引物 3’端不含较多的 AT 碱基，且与其他引物不存在互补序列。最后，各引物所识别的序列片段间应有一定合适的间距，如 F2 末端至 B2 末端(LAMP 扩增区域)间距 120~160 个碱基，F2 的 5’端至 F1 的 5’端(形成环结构的区域)间距 40~60 个碱基，F2 与 F3 间隔 0~60 个碱基(图 6.7)
图 6.7 LAMP 引物间距
LAMP 引物设计流程:首先进行常规 LAMP 引物(FIP、BIP、F3 和 B3)的设计，经实 际扩增反应验证，结果满意的可以选做 LAMP 引物。如果没有出现有效扩增，或者扩增结 果不理想，则需要重新进行引物设计。进而利用所选择的 LAMP 常规引物序列进行环引物 的设计，同样需经实验验证，可有效提升扩增速率的才可选做环引物，否则需重新进行设计。 当然，环引物对于 LAMP 扩增不是必须的。
LAMP 引物设计可以使用在线设计软件 PrimerExplorer (http://primerexplorer.jp/e/)。软 件操作分为简易模式和专业模式两种。前者不需要改变引物设计参数，并自动缩小侯选引物 对范围，给出按优先级排序的可能产生有效扩增的 5 套候选引物。专业模式用于特定引物的 设计，用户可以改变引物设计参数，并可以规定所设计的引物对数量。通常对于一般序列(45 <GC% < 60)引物设计参数为默认设置，如果是 AT 富含序列(GC% < 45)或者 GC 富含序 (GC% > 60)，则引物的设计参数应满足表 6.1 中的要求。
表 6.1 特殊靶序列的 LAMP 引物设计参数要求 59
当靶序列载入系统后，PrimerExplorer 会自动判断 GC 含量，并将靶序列按照 AT 富含 序列(GC% < 45)、一般序列(45 <GC% < 60)和 GC 富含序(GC% > 60)三种类型分别 匹配不同的引物设计参数。系统可以对设计出的引物末端序列进行自动检查，去除存在互补 序列(如 CCCGGG、GAATTC)或者多个相同核苷酸序列(如 CCGGGG、AATTTT)的引 物对。同时还会检查引物与靶序列的互补性，如果引物末端与扩增区以外的靶序列也存在互 补，则可能产生非特异性扩增，这样的候选引物也需去除。所设计的引物关键信息如引物在 靶序列中所在位置、Tm 值等可以自动保存并下载到 Excel 文件中。
下面以人星状病毒 1 型(Human astrovirus, HAstV)为例简要介绍 LAMP 引物设计的一 般过程。首先选择 HAstV 的衣壳蛋白编码基因(ORF2)作为靶序列(长度 1994 bp)。在 PrimerExplorer V5 的起始页面(图 6.8)点击“浏览”按钮，导入靶序列文件。靶序列长度应 小于 2kb，文件格式可以是 TXT(仅含序列)或 FASTA，也可以是 GenBank 格式。然后选 择引物设计条件参数，默认的参数设置为“Automatic Judgment”，该状态下会自动计算序列 的 GC 含量，并自动匹配合适的引物设计条件，点击“Primer Design”，进入引物设计页面(图 6.9)。点击“Generate”按钮，在右侧方框内即可显示有 5 对引物生成，继而点击“Display”按 钮，则进入引物列表页面(图 6.10)。可以点击“Save List”将引物列表信息保存到 Excel 文件 中。选中窗口左侧“Primer ID”对应的方框后点击“Confirm”，则出现引物对信息核查界面(图 6.11)，根据引物对关键参数以及所扩增的靶序列是否符合预期从而选出最优引物对。在比 对分析引物性能时，需要特别关注 F2、B2 的 3’端，F1c、B1c 的 5’端，它们作为扩增的起 始位点，其稳定性非常重要。因此，代表稳定性的关键参数∆G 应小于等于-4.0kcal/mol，也 就是说末端∆G=-6.5kcal/mol 比末端∆G=-4.0kcal/mol 的引物更稳定。在每个引物对 ID 号的上 方，有一个“Primer Information”按钮，点击并保存文件以备用于后续环引物的设计。
图 6.8 引物设计起始页面
图 6.9 引物设计页面
图 6.10 引物列表页面(部分) 绿色大写字母代表 F3 区，蓝色大写字母代表 F2 区，黑色小写字母代表 F1c 区，黑色大写 字母代表 B1c 区，蓝色小写字母代表 B2 区，绿色小写字母代表 B3 区
图 6.11 引物对信息核查界面
设计环引物时，回到引物设计的初始界面(图 6.8)，点击“浏览”按钮后选择所保存的 “Primer Information”文件，然后点击“Primer Design”，进入环引物设计窗口(图 6.12)，保持 默认参数设置，直接点击“Generate”按钮，显示有 4 套环引物生成，点击“Display”，进入环 引物列表界面(图 6.13)，同样选中某环引物 ID 号左侧的方框，点击“Confirm”，进入环引 物信息核查界面(图 6.14)，同样按照常规引物的筛选原则选出最优的环引物。
图 6.12 环引物设计界面
图 6.13 环引物列表界面
图 6.14 环引物信息核查界面
LAMP 方法已被用于临床、食品和环境样本中多种病原的检测，如细菌、病毒、寄生虫 和原生动物等。其扩增产物的检测存在多种方式，且不断向更加准确、简便、高效的方向发展。
首先，LAMP 扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。LAMP 扩增后可以产生大 量具有不同长度、不同数目茎环结构和反向重复序列的 DNA 混合物，琼脂糖凝胶电泳呈现 瀑布状梯形条带。针对扩增产物中所包含的特异性酶切位点进行酶切，还可以对扩增产物的特异性进行验证。例如 Shirato K 等人建立的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV) 64 RT-LAMP 检测方法中，分别利用限制性内切酶 NlaIII和 XbaI对 A 亚型扩增产物和 B 亚型 扩增产物进行酶切，37°C作用 1h 后电泳检测，特异性扩增产物会由原先的瀑布状梯形条带 变为清晰可数的几条电泳条带(图 6.15)。电泳检测的缺点是需要打开扩增管，高浓度 DNA 产物容易产生气溶胶造成实验室环境污染。
图 6.15 RSV LAMP 扩增产物酶切后琼脂糖凝胶电泳图
其次，Mori 等人于 2001 年提出了一种可以在密闭系统中通过浊度分析鉴定 LAMP 扩增 的方法。由于 LAMP 反应效率极高，在 15~60min 内便可使 DNA 的量放大 109~1010 倍，在 核酸大量合成时，从 dNTPs 析出的焦磷酸根离子与反应缓冲液中的镁离子结合，产生副产 物—焦磷酸镁，形成乳白色沉淀。而且焦磷酸镁的产量与扩增产物浓度存在一定相关性，因 此可在扩增的终末阶段肉眼观查乳白色沉淀判断扩增有效性，还可以通过浊度仪来实时监测 浊度的变化情况。利用实时浊度仪每隔 6s 记录一次反应液在 400nm 处的吸光值(OD400)， 可以对反应管中的浊度变化进行动态监测，借以分析整个扩增反应的动态过程。一般将扩增 反应的阈值线设定在 0.1(大于阴性对照平均浊度值的 2 倍以上)，浊度值超过 0.1 即认为是 阳性反应，而扩增过程中反应体系浊度达到阈值线时所对应的扩增时间称之为阈时间，以 Tt(Treshold time)表示。扩增的靶标分子含量越高，阳性信号出现的就越早，Tt 值就越小。 例如，RT-LAMP 对 10 倍梯度稀释的星状病毒 RNA 标准品进行检测，发现病毒 RNA 稀释 度越高，反应出现阳性信号所需要的时间(Tt)也越长，以病毒 RNA 浓度对数值为横坐标， 对应的阈时间为纵坐标绘图，发现星状病毒 RNA 在 102-107 拷贝数范围内模板量同阈时间存 在良好的线性关系，线性相关系数(R2)为 0.9905。类似于实时荧光 RT-PCR，这使得 RT-LAMP 也可以作为一种合适的定量工具，用于样品中病毒 RNA 拷贝数的定量分析。
然而，由于浊度信号是来源于核酸扩增的副产物，而不是引物特异性扩增的直接产物， 因此无法完全排除检测到非特异性扩增的可能。由宿主来源的近源 DNA 片段或引物二聚体 产生的非特异性 DNA 扩增都有可能带来浊度信号的增加，尽管这种情况很少见，还是应引 起足够的重视，特别是在建立 LAMP 检测方法时，应对引物的完整性和适用性做充分的验 证和比对分析。
图 6.16 LAMP 扩增产物目视检查混浊
图 6.17 星状病毒 RT-LAMP 扩增实时浊度检测:浊度变化动态曲线(A)与扩增标准曲线 (B)
此外，染色检测法。根据染料对反应是否产生抑制，染料可在反应后或反应前添加。但 在反应后开盖添加，易在空气中产生气溶胶，并在之后的检测中造成假阳性。染料和辅助剂 的种类都会对反应效率及结果判断造成影响。因此，根据染料、辅助剂的作用特点进行合理 的选择及应用，对 LAMP 结果的正确性和可靠性有重要意义。染料的种类有很多，应用较 多的有 3 种:钙黄绿素、SYBR Green 和羟基萘酚蓝 ( 表 6.2 ) 。
SYBR Green I 是一种荧光染料，反应结果阳性时体系呈绿色，阴性体系呈橙色，肉眼 就可观察反应结果，也可置于紫外灯下观察反应结果。但荧光染料的使用具有两面性，使用 不同的核酸染料会对 LAMP 反应造成一定的影响。若是反应前加入，由于荧光染料对 DNA 分子的高结合力和亲和力(因为荧光染料会与双链 DNA 的小沟部分结合，一旦结合其荧光 信号会增强 800~1000 倍)，从而阻碍 Bst DNA 聚合酶链置换活性。反应结束后开盖加入， 存在气溶胶污染，从而造成假阳性。不少试验人员选择反应前将 SYBR Green I 滴加于反应 管的盖上，反应结束后，将染料弹入或离心与反应体系混匀，这种操作方式避免了对反应效 率的影响以及产生气溶胶污染。但需注意的是，在 PCR 仪开启热盖的模式下，染料会变干 凝固，不易回溶，所以宜采用水浴或 PCR 仪不开热盖的模式。使用 SYBR Green I 并不能做 到特异性的显示扩增产物，引物二聚体或非特异性扩增产物也能结合荧光染料显色，易造成 假阳性，对引物的设计要求较严格。
图 6.18 LAMP 法 SYBR Green I 染色结果
钙黄绿素( Calcein) 是一种络合指示剂和荧光指示剂。Tomita 等用钙黄绿素和氯化锰开 发了一种有效的 LAMP 终点检测方法。将钙黄绿素溶于二甲基亚砜( DMSO) 成 5 mmol /L 溶液，再用蒸馏水配制成 0.5mmol /L 钙黄绿素、10 mmol /L MnCl2 的储备溶液。钙黄绿素 与 Mn2+结合时处于荧光淬灭状态，当随着大量 DNA 双链的合成，反应体系当中产生的焦磷 酸根离子副产物，使得 Mn2+与磷酸根结合生成沉淀解除淬灭状态，钙黄绿素与 Mg2+结合， 又产生荧光。但在 2010 年，Wastling 等发现，与没有添加指示剂的反应相比，加入钙黄绿 素似乎降低了 LAMP 的敏感性。实际上，钙绿黄素的使用对反应体系当中的 Mg2+的浓度要 求很高，有一定的偏差，都会造成反应结果误差，在低浓度的 Mg2+条件下，酶活性降低， 产物量下降，在 Mg2+浓度过高时，会出现非特异性反应，所以应选择合适的 Mg2+浓度。钙 黄绿素在一定程度上抑制了 LAMP 反应，另一个原因是钙黄绿素和双链 DNA 之间的相互 作用导致了反应灵敏度的降低。Loopamp 荧光检测试剂(LMP221) 的主要成分为钙黄绿素， 并就其对紫外线的照射要求进行了研究，发现: 当钙黄绿素处于短波长(240 nm)到长波长 (370 nm)时，产生黄绿色荧光; 在中间波长(325 nm)的激发光下荧光最强; 当激发光接 近 320 nm 时，虽然从阳性样品观察到的荧光增强，但阴性对照的荧光也加强。因此，建议 在短波长(240~260 nm)或长波长(350~370 nm)的激发光下进行 LAMP 可视荧光检测， 通过比较样品与阳性、阴性对照的荧光强度进行判断。
图 6.19 LAMP 法钙黄绿素染料紫外灯下显色结果
羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue，HNB) 也是一种金属离子指示剂，可与反应体系当中的 Mg2+结合而成紫罗兰色，当 DNA 双链合成后，生成焦磷酸镁，失去镁离子的 HNB 就变成了天蓝色。HNB 在终浓度为 120 μmol /L 时对扩增没有抑制，可在反应前加入。但是 该种染料在紫外灯下颜色区分不明显，且无成品化试剂，进行反应时需要按照一定浓度现用 现配，且 HNB 不稳定，不容易保存，使用不便。另一个问题是 HNB 的颜色反应肉眼区别 不明显，不容易察觉颜色变化，虽然目前很多研究者在使用本方法，但并没有获得大家的认 可。
图 6.20 LAMP 法 HNB 染色结果
上述 3 种染料相互比较，SYBR Green I 和 HNB 的检测灵敏度比钙黄绿素高 10 倍，可 能由于 Mn2+的抑制，或者钙黄绿素与 DNA 的相互作用引起钙黄绿素灵敏度的降低。
最后，还可通过恒温扩增微流控芯片实时观察反应结果。微全分析系统(Miniaturized Total Analysis Systems，TAS)或称芯片实验室(Laboratory-on-a-Chip，简称 LOC)是跨学 科的新领域，目标是通过分析化学、微机电加工(MEMS)、计算机、电子学、材料科学及 生物学、医学的交叉，实现化学分析系统从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化 与便携化。微流控分析(Microfluidic Analysis)是微全分析系统的主要组成部分， 而将化 学分析的多种功能集成在邮票大小的芯片上的微流控芯片(Microfluidic chips)又是当前最 活跃的发展前沿，代表着 21 世纪分析仪器走向微型化、集成化的发展方向。具有微小可控、 功能集成的微流控芯片， 能够简化操作过程、加快分析速度，还可避免常规方法中样品转 移所带来的损失和污染， 为病原微生物等的分析提供了一个新的平台， 对于发展强大的生 物分子床边快速诊断(Point of care testing，POCT)具有非常重大的意义。
基于微流控芯片的核酸扩增检测系统(Nucleic acid amplification test，NAAT)是微流控 技术最有前景的应用之一，它简化了核酸扩增检测中繁琐的样品前处理和扩增产物检测步骤。 在多种 NAAT 检测方法中，LAMP 与微流控技术结合的核酸扩增检测系统则最有潜力被应 用在 POCT 上。近年来已有不少研究报道将环介导等温扩增与微流控芯片结合，用于检测 病原微生物、癌症生物标志物及其他靶基因。该方法具有特异性强、敏感度高、耗样量少、 耗时短、检测效率高、操作简便等诸多优点。整合环介导等温核酸扩增和微流控芯片技术，建立单重/多重、定性/定量 LAMP 微流控芯片模块，发展快速、灵敏、特异和适合床边检测 的生物分子分析技术，将为我国食品安全、重大传染病防治、肿瘤及遗传性疾病等的快速准 确诊断提供强有力的技术保障，为创新技术的发展提供良好的示范和引导。
（未完待续）
基于微流控芯片的核酸扩增检测系统是微流控技术最具前景的应用方向之一，它简化了核酸扩增检测中繁琐的样品前处理和扩增产物检测步骤。在多种检测方法当中，环介导等温扩增技术（LAMP）与微流控检测技术结合的核酸扩增检测系统非常适合于应用于POCT（床边检测）。根据国内外相关研究报道，环介导等温扩增微流控技术已经应用于检测病原微生物、癌症生物标志物以及其他标志物检测领域。
本文采用【图解】的方式，讲解环介导等温扩增微流控检测技术的原理、分类以及应用。
什么是环介导等温扩增
环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）是2000年由日本荣研株式会社的Notomi等人提出的一种新型核酸扩增技术。该技术依靠4-6条特异性引物和一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶（Bst DNA聚合酶），在等温条件（60-65℃）下扩增靶序列，避免的传统PCR需要变温扩增而对精密仪器的依赖性，同时具有快速、高效、特异性强的特点。
环介导等温扩增微流控检测技术
2004年，Hataoka研究团队设计了一块十字通道的PMMA微流控芯片用于LAMP检测前列腺特异性抗原cDNA。
环介导等温扩增具有操作简便、快捷、高效、特异性等特点，能满足微流控集成诊断系统的要求，实现两种技术的完美结合。同时微流控技术也可以为LAMP核酸检测系统提供形状、大小不同的微量密闭反应通道及微反应空间，有效克服了LAMP易产生气溶胶，造成实验污染的弊端。微流控技术可提供平行且互不干扰地微反应区，可以构成多通道环介导等温扩增诊断集成系统。
环介导等温扩增微流控技术分类
碟式LAMP微流控检测技术
周杰等采用北京博奥晶典生物技术有限公司RTisochip-A 恒温扩增微流控芯片分析仪，基于环介导恒温扩增技术对转基因农作物样品中靶标基因进行检测。该碟式芯片共有24个样品检测孔，每个孔体积为2.2uL。检测时间为30min，该检测试剂可以大大缩短检测时间和降低检测成本。
Abkar Ahmed Sayad 等开发出一种碟式离心型微流控装置。该装置分为三层，底部PMMA层，中间压敏胶（PSA）粘合层和底部PMMA层。微流控通道通过切刻机在底层制作出混合试剂、测量、 等温扩增和检测的微流控腔室。LAMP 实验的排气和装载孔、蜡、密封材料放在微流控 CD 顶层。该系统，对添加沙门氏菌的番茄进行检测，检出限为 5×10-3 ng/uL。整个过程，从样品制备到检测，可以70min内在微流控 CD 上全自动化完成。
Zhou等运用碟式离心聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）芯片荧光 LAMP 检测法，成功实现了一类弧菌的芯片 LAMP 快速检测，检测时间仅用30min，芯片LAMP扩增较之常规LAMP扩增，具有操作简便，扩增速度快，便于携带，实时快速等优点，相对于常规LAMP 检测法耗材量大大降低。
卡式LAMP微流控检测技术
美国Rheonix公司开发的基于微流控技术的 CARD 芯片，该芯片集成泵、阀门、微通道、反应和试剂储液池，以及通用DNA阵列。CARD芯片采用聚苯乙烯均聚物注塑而成，可以用于免疫检测和核酸检测。Chen 等可在60min内，使用 CARD 芯片提取人类免疫缺陷病毒（HIV）RNA ，20min内完成进行 RT-LAMP 检测，分析灵敏度可达每毫升 103 病毒颗粒（103vp/mL）。此外，台式 RT-LAMP 和 CARD 芯片上的分析结果显示加入病毒与结果CT值的一致性，说明CARD芯片具有与劳动密集型的台式LAMP同样的处理能力。
Dou等研发了一种PDMS-纸混合微流控装置，PDMS不用复杂的表面处理，无大型设备，将“纸”的技术引入到微流控LAMP装置中。该装置包括三层，两个PDMS层和一个玻璃载片底层。首层PDMS用于试剂递送，包含三个微通道和一个加样入口。中间PDMS层由底部的6个孔道组成，作为LAMP反应区。底层为用于支撑的玻璃载片。该装置可以在45min内检测最低为3个拷贝的脑膜炎奈瑟氏球菌。
数字式LAMP微流控检测技术
Coelho等设计了一种T型数字微流控芯片，使用数字微流控与LAMP结合的技术扩增癌基因c-myc 0.5 ng/uL靶标DNA只需45min，反应液仅需1.54ul，远远低于台式反应技术。
Wan等为了进一步加强LAMP反应的特异性，开发了一种使用分子信使DNA探针的病原体数值微流控系统。该系统仅需1uL的LAMP反应样品。可以在40min内检测最低10个拷贝。该检测速度比传统商品定量PCR设备的快3倍。并且有效解决LAMP假阳性问题，区分特异性反应产物和非特异性反应产物。
集成式LAMP微流控检测技术
Song等研制了一种简单易于操作，价格低廉，POCT集成式，RT-LAMP微流控芯片装置，可用于寨卡病毒检测。该装置在杯盖抽屉内集成了镁-铁反应的热源，来控制LAMP反应温度。一次性微流控芯片完成病毒核酸的捕获、浓缩、提纯、等温扩增和检测。扩增产物的检测不需要额外的仪器，采用无色结晶紫染料进行目测。整个装置可以在40min内完成口腔样本中寨卡病毒灵敏度5个单位。
LAMP微流控检测技术展望
本文介绍了四种类型的LAMP微流控检测技术，虽然微流控结构大不相同，但是均集成了LAMP技术和微流控技术的优势，特异性强、灵敏度高、样品消耗少、节省时间、检测高效和操作简便。应用领域涉及，疾病监测和管理、病原体鉴定、环境监测、流行病学调查及遗传病的检测。因此，相信随着这项技术的不断完善，不久将来，LAMP微流控检测技术的产品会相继进入市场，为人类生命健康发展和生态环境保护起到重要的推进作用。
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