固态发酵分泌蛋白提取方法

一、实验准备

1、蛋白提取液

PBS缓冲液（~pH 8.0）：蛋白质组分析用蛋白提取液

1 L中含有磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.44g，氯化钠(NaCl) 8g，氯化钾(KCl):0.2g。

醋酸钠缓冲液（50 mM，~pH 4.7）：测定漆酶、过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶用提取液。

2、100%TCA储藏液

称取100 g TCA加入45.4 mL蒸馏水，配置成为100% TCA储藏液。

3、其他试剂

TCA：三氯乙酸

CP：丙酮

4、耗材

三角瓶、纱布、50 mL离心管

5、仪器设备

移液枪，天平、离心机、超低温冰箱、摇床

 

二、注意事项

1、如果用CP-TCA沉淀效果更好，如果CP难以购买可以用TCA沉淀法，如果TCA沉淀效果不好可以尝试加入磷钨酸溶液来增强沉淀效果【51644】。

2、如果多糖会影响后续实验的开展，建议采用苯酚法进行后续的蛋白沉淀，苯酚提取方法能够更好的去除多糖。

 

三、菌包分泌蛋白提取

1、将菌包取出，从上到下将菌包四等分，菌包1/4处作为样本取样位置，从1/4位置上下各1 cm（共2 cm）的位置进行取样。

2、利用手术刀将1/4位置上下各1 cm的菌包取出来。

3、将外圈1 cm的覆盖有菌丝的部分去除，如果是中央接种，把中间部分靠近菌丝的1 cm的部分也去除。

这样做的目的主要是担心外圈的营养条件和微环境与中间不同，因此分泌蛋白表达模式会存在差异。

保证中间剩余的培养物的重量大于10 g以上，否则可能不会得到足够量的蛋白。

4、用手轻柔的将培养物掰碎，不要用力粉碎（防止菌丝体内部蛋白流出），将培养物称重之后加入到三角瓶中。

加入4倍体积蛋白提取液（V/W），稍微混匀后，置于25℃-30℃恒温摇床中震荡提取10~30 min。

（实验结果证明震荡10-30 min分泌蛋白表达模式并无显著差别）

5、在50 mL离心管中垫上4层纱布，将震荡后的提取液通过纱布进行过滤。

6、将滤出液10000 - 12000 rpm离心10 min，取上清，将上清转移到新的离心管中置于-80摄氏度冰箱进行保藏。

 

四、蛋白沉淀（TCA沉淀法）

1、每9 mL的蛋白提取液中加入1 mL的100% TCA储藏液（TCA终浓度为10%），混匀后，置于-20℃冰箱中沉淀过夜；

2、10000-12000 rpm离心10 min，弃上清。

3、加入1 mL预冷的丙酮洗涤沉淀（需要把沉淀悬浮起来），将蛋白悬浊液转移到新的2.0 mL离心管中。

4、12000 -15000 g离心2 min，丢弃上清。

5、重复用预冷的丙酮洗涤一遍。

6、开盖使丙酮挥发，得到分泌蛋白（注意不要让蛋白过于干燥，否则不容易重悬），该蛋白可以在-80℃冰箱长期保存。

7、根据后续实验需求利用0.3 mL蛋白溶解缓冲液溶解蛋白，并进行蛋白浓度测定。

 

四、三角瓶固体发酵蛋白提取

方法整理中......

 

五、蛋白沉淀（CP-TCA沉淀法）

方法整理中......

 

六、蛋白沉淀（Phenol法）

方法整理中......

 

 

主笔：于浩、李晓航